Dezoito anos depois, Blus Brothers 2000 pega onde acabou o primeiro filme, "Mission from God", com Elwood Blues (Dan Aykroyd) a sair daprisão e a descobrir que muito mudou durante o tempo que esteve detido. O seu parceiro Jake morreu, a sua banda desapareceu há muito e o orfanato onde crescera foi demolido. Even Curtis, que no orfanato tinha a custódia de Jake e Elwood, também morreu, fazendo com que o único parente vivo de Elwood seja Cabel (Joe Morton), o filho bastardo de Curtis - seu quase meio-irmão. Cabel, um polícia obtuso e direitinho, não reconhece quaisquer laços familiares e está convencido de que Elwood continua a não prestar para nada. Quando procura a ajuda da sua ex-professora, a irmã Mary Stigmata, Elwood encontra-a a trabalhar num hospital com um problema muito dela: está por um triz com Buster (J. Evan Bonifant), um míudo orfão de dez anos seriamente necessitado de um "mentor". Reconhecendo que "Deus actua por caminhos misteriosos", Elwood conclui que está imbuido de uma nova missão: reunir a antiga banda, competir na "Queen Mousette's Battle of the Bands" em Louisiana e conduzir o desobediente Buster no caminho da redenção. Com Elwood, esse caminho leva-os direitinhos a uma boîte de striptease onde eles se entendem logo com o barman Mighty Mack McTeer (John Goodman), que sabe uma ou outra coisa sobre Blues. Partem então os três com o objectivo de reunir a banda, tentando o seu melhor para se manterem à frente de Cabel e da polícia, bem como da Mafia russa de Chicago e de um grupo de extrema direita. Blues Brothers 2000 conta com o regresso de nomes como Aretha Franklin, James Brown, Jeff Morris, B.B. King, Kathleen Freeman, Paul Schaffer e muitos outros nomes grandes dos Blues.